操作步驟：

1將血細胞分離機分離(2-3個(gè)循環(huán)， 約1X 10個(gè)細胞)的血細胞懸液分成2 ~3份分別加在50m1離心管中，室溫，1500rpm，離心20min.

2.收集上層的血漿層，滅活后用于CIK的培養。加生理鹽水對信稀釋剩余的血細胞懸液，混勻，分別加至15ml的淋巴細胞分離液上(2^3管) .

3.室溫，200rpm， 離心20min (升9.降3)，分離PBMC.

4.棄上清，用無(wú)血清培養基重懸細胞沉淀。

5.取100 u 1細胞懸液進(jìn)行計數(具體方法詳見(jiàn)白細胞計數和成活率計算SOP)，苔盼藍染色，計數并記錄實(shí)驗結果。

6.將細胞懸液按照-一定的細胞密度進(jìn)行稀釋?zhuān)靹蚝箐伵囵B瓶，每瓶加細胞懸液10ml,置于37C，50.培養箱中貼壁培養30min-2h.

DC胞的誘導:

7 .DC培養基的配置:用1m1無(wú) 血清培養基復溶DC添加劑，網(wǎng)時(shí)將終濃度為2%白蛋白(體積比)，1mM Gln-并加入到無(wú)血清培養基中，并進(jìn)行混勻，定容到200ml，配置好的培養基即為人DC細胞培養基。

8.30min-2h后，取出培養瓶，吸去上層未貼壁的細胞懸液，井用10ml無(wú)血清基洗滌貼壁的細胞一次。 在培養瓶中添加15ml的人DC細胞培養基，混勻后，將培養瓶置于37C. 54CO :的培養箱中培養。

9.分別于第二。四天給每瓶補加人DC細胞培養基5ml.

TMF-c的刺激:

10.于第六天收獲未成熟DC細胞。

11 .6瓶75cm'培養瓶中每瓶吸出15m1培養液(剩余10m1培養液)，至50m1的離心管中，室溫，1400rpm， 離心8min.

12.棄上清，用含DC細胞培養添加劑，2%白蛋白，ImMGln的DC細胞培養基50ml重懸沉淀的細胞，細胞懸液中加入TNF-a,加入的量為終濃度10ng/ml.細胞懸液混勻后鋪原75cn’培養瓶中，每瓶約8. 6ml.

?13.培養瓶置于37C，5%CO孵箱中過(guò)夜培養

DC細胞的成熟：

14.第七天，取出細胞培養瓶，用細胞刮刀將細胞刮起，收集細胞懸液，并用1^2ml生 理鹽水洗培養孔一遍， 合并洗液和細胞懸液，1500 rpu，室溫離心8min.

15.棄上清，以手指在離心管外輕輕彈開(kāi)沉淀，并將其巫懸于50ml的生理鹽水中，1500 rpu,室溫離心8min.并重復此過(guò)程2遍。

16.第三遍洗滌細胞時(shí)，離心前取出1001細胞懸液計數，苔盤(pán)藍染色，使用血細胞記數器按照標準的操作程序進(jìn)行計數，并進(jìn)行流式表型的檢測。

?

?